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綠原酸（CGA）是由咖啡酸和L-奎尼酸形成的酯，具有廣泛生物活性，例如抗糖尿病、神經(jīng)保護(hù)等作用，已有研究報道CGA可有效抑制腫瘤生長，這在許多臨床前模型和膠質(zhì)瘤患者的II期臨床試驗中得到了證實。然而，其直接蛋白靶點和相關(guān)抗癌機制仍然未知。2024年7月6日，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所胡海宇、陳曉光團(tuán)隊在Acta Pharm Sin B（IF=14.7）發(fā)表題為“Target fishing and mechanistic insights of the natural anticancer drug candidate chlorogenic acid”的研究文章，開發(fā)光親和探針PAL-CGA揭示了ACAT1是綠原酸（CGA）的關(guān)鍵靶點，并證明CGA通過阻斷ACAT1的Y407磷酸化來抑制癌癥增殖，凸顯了其在癌癥治療中的臨床潛力。

1、新型光親和標(biāo)記CGA探針 PAL/CGA的設(shè)計和合成

研究者基于文獻(xiàn)對CGA 類似物的SAR研究，推斷奎寧酸上的羧酸部分可以在不喪失CGA活性的情況下進(jìn)行修飾，由于標(biāo)記分子量較大的生物素可能會顯著影響探針的活性和細(xì)胞通透性，因此采用了生物正交方法，設(shè)計合成了光親和標(biāo)記CGA類似物PAL/CGA，并使用1H NMR，13C NMR和HRMS表征探針PAL/CGA的結(jié)構(gòu)（圖1）。

圖1 CGA和PAL/CGA的結(jié)構(gòu)

2、ABPP篩選PAL/CGA的蛋白靶標(biāo)

首先通過細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)CGA降低人黑色素瘤 A375 細(xì)胞增殖，探針PAL/CGA與CGA的抗癌活性一致，表明添加雙功能標(biāo)簽不會明顯干擾母體藥物活性。進(jìn)一步作者分離了A375腫瘤組織的線粒體，通過ABPP方法確定CGA的特定蛋白質(zhì)靶點，鑒定并確認(rèn)其中一種捕獲的蛋白質(zhì)是線粒體ACAT1（線粒體乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶1）。酶活實驗顯示CGA對ACAT1的抑制作用比陽性對照AH（ACAT1抑制劑）的更強（圖2）。

圖2 ABPP篩選PAL/CGA的蛋白靶標(biāo)

3、CGA與ACAT1相互作用的驗證

通過SPR、ITC、熱位移分析（TSA）和藥物親和力響應(yīng)靶標(biāo)穩(wěn)定性（DARTS）驗證了CGA和ACAT1之間的親和力和結(jié)合動力學(xué)。與陽性對AH相比，CGA在較低濃度下更有效地保護(hù) ACAT1 蛋白水解（圖3）。

圖3 體外驗證CGA與ACAT1相互作用

隨后通過2種細(xì)胞系評估了細(xì)胞裂解物和活細(xì)胞中的ACAT1-CGA相互作用，與上述使用純化重組ACAT1結(jié)果一致，DARTS測定表明CGA有效保護(hù)ACAT1蛋白免于在A375和NCI-H1299細(xì)胞裂解物中發(fā)生劑量依賴性降解。此外，使用CGA熒光探針發(fā)現(xiàn)ACAT1敲低細(xì)胞系中CGA熒光強度顯著降低，證明了ACAT1是CGA結(jié)合蛋白（圖4）。

圖4 體內(nèi)鑒定ACAT1為CGA結(jié)合蛋白

4、CGA與ACAT1的低溫電子顯微鏡（EM）結(jié)構(gòu)

先前的研究表明ACAT1的共價抑制劑AH可與ACAT1四聚體結(jié)合并將其破壞為單體，從而使酪氨酸激酶無法磷酸化和穩(wěn)定激活ACAT1。為了闡明CGA的抑制機制作者采用低溫電子顯微鏡（cryo-EM）來研究 ACAT1/CGA 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示與共價抑制劑AH相反，與CGA孵育時對四聚體和單體ACAT1蛋白之間的平衡沒有影響，這表明ACAT1的活性抑制可能是由于四聚體的廣泛構(gòu)象變化，而不是將ACAT1四聚體破壞成單體。為了證實CGA直接靶向ACAT1 α螺旋腔中的Ala 401殘基，作者將Ala（A）替換為Phe（F），發(fā)現(xiàn)可以阻止CGA與ACAT1的結(jié)合，使用ITC分析也證實CGA無法與突變蛋白結(jié)合（圖5）。

圖5 CGA與ACAT1的低溫電子顯微鏡（EM）結(jié)構(gòu)

6、CGA對ACAT1功能的影響

代謝失調(diào)是癌癥的標(biāo)志之一，而ACAT1是腫瘤發(fā)生的重要代謝調(diào)節(jié)劑。有研究報道上調(diào)的致癌酪氨酸激酶使ACAT1的Y407磷酸化并穩(wěn)定其活性四聚體形式，進(jìn)而抑制丙酮酸脫氫酶（PDH）活性，促進(jìn)糖酵解，導(dǎo)致腫瘤生長。因此，抑制ACAT1活性會消除ACAT1對PDH的抑制作用并減少腫瘤生長。作者發(fā)現(xiàn)CGA 處理有效抑制了 A375 和NCI-H1299細(xì)胞系中的Y407 磷酸化，增加PDH 活性，此外，CGA處理不影響四聚體的形成，但降低了四聚體ACAT1的Y407磷酸化。這些結(jié)果表明，CGA對ACAT1的抑制可能是由于Y407磷酸化的中斷，而不是將 ACAT1四聚體破壞為無活性的單體（圖6）。

圖6 CGA降低ACAT1四聚體Y407磷酸化

最后，利用異種移植裸鼠驗證CGA作用機制，發(fā)現(xiàn)ACAT1敲低的異種移植瘤生長速度和重量顯著降低，且接受CGA治療的異種移植瘤生長減緩，但CGA治療并不能進(jìn)一步減少ACAT1敲低的異種移植瘤的體積和重量。此外，接受CGA治療的異種移植小鼠腫瘤中的ACAT1活性顯著降低（圖7）。

圖7 CGA降低Y407磷酸化抑制癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長

總結(jié)

研究表明CGA是一種新型非共價ACAT1抑制劑，可有效結(jié)合ACAT1四聚體，消除Y407磷酸化，降低ACAT1活性，消除ACAT1對PDH的抑制作用，減弱癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長（圖8）。

圖8 CGA阻斷ACAT1的Y407磷酸化來抑制腫瘤增殖

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